反相液相色譜法測(cè)定地榆中金絲桃苷的含量

【摘要】目的建立地榆中金絲桃苷的液相色譜含量測(cè)定方法。方法采用RP-HPLC測(cè)定，C18柱，流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸溶液（46∶54），用三乙胺調(diào)pH至3.0，流速1.0 ml·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm；供試品溶液的制備采用甲醇超聲提取。結(jié)果測(cè)定了不同產(chǎn)地不同批次的地榆藥材，金絲桃苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.052%～0.291%。結(jié)論該方法靈敏快速，準(zhǔn)確可靠，可用于地榆的質(zhì)量控制。

　　【關(guān)鍵詞】  地榆 金絲桃苷 反相液相色譜法

　　Abstract:ObjectiveTo establish a determination method of hyperoside in Sanguisorba officinalis. MethodsRP-HPLC analytical method was established on a Polaris C18column with Methanol-0.2%H3PO4 solution（46:54） as the phase, the flow rate was 1.0 ml·min-1, and the detection wavelength was 370 nm. The method of sample was ultrasonic wave withdraws by Methanol. ResultsThe content of hyperoside was from 0.052～0.291% in different groups of S. officinalis collected from the different locations. ConclusionThe method is  accurate and can be used for the quality of Sanguisorba officinalis.

　　Key words:Sanguisorba officinalis;   Hyperoside ;  RP-HPLC

　　地榆為薔薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或長(zhǎng)葉地榆Sanguisorba officinalis L.var.longifolia（Bert.）Yu et Li 的干燥根。其味苦、酸、澀，微寒，具有涼血止血、解毒斂瘡之功效［1，2］。現(xiàn)代藥理研究表明其具有顯著的鎮(zhèn)痛作用［3］，主要有效成分為黃酮類化合物，但藥典記載質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定量檢測(cè)方法僅為紫外-可見分光光度法測(cè)定其鞣質(zhì)含量，該法操作繁瑣。金絲桃苷為地榆藥材中提取得到的黃酮類化合物。研究表明，地榆中的金絲桃苷是其止痛作用的有效成分之一。本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地中藥材市場(chǎng)商品地榆的金絲桃苷成分進(jìn)行了定量分析，考察了流通商品地榆的質(zhì)量狀況，為進(jìn)一步提高地榆藥材的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

　　1  儀器與試藥

　　Agilent 1100液相色譜儀，含在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、智能柱溫箱、紫外可見光檢測(cè)器（VWD）、化學(xué)工作站。KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

　　地榆藥材于200607中下旬從青海省各地中藥材市場(chǎng)抽取，由青海省藥品檢驗(yàn)所主任藥師劉海青鑒定為地榆S. officinalis L.的干燥根或飲片。實(shí)驗(yàn)中將樣品粉碎后過(guò)100目篩，置干燥器中備用。

　　金絲桃苷（111521-200303，國(guó)藥品生物制品檢定所,供含量測(cè)定用）。甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。其他試劑均為分析純。

　　2  方法與結(jié)果

　　2.1  對(duì)照品溶液的制備

　　精密稱取金絲桃苷13.25 mg，置量瓶中，加甲醇定容至25 ml，其金絲桃苷含量為0.53 mg·ml-1。再精密吸取金絲桃苷對(duì)照品溶液2.0 ml，加甲醇定容至50 ml量瓶中，其金絲桃苷含量為0.021 2 mg·ml-1。

　　2.2  供試品溶液的制備

　　取地榆干燥藥材或飲片的粉末（過(guò)100目）1 g，分別精密稱定，至具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，超聲提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，用續(xù)濾液作為供試品溶液。

　　2.3  色譜條件

　　Hypersil ODS2分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸溶液（46：54），用三乙胺調(diào)pH至3.0；流速1.0 ml·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量10 μl；在選定的色譜條件下，色譜柱的分離效率（簡(jiǎn)稱柱效）>理論塔板數(shù)以金絲桃苷峰計(jì)算不低于3 000。分離度大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。色譜圖見圖1。

　　2.4  檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

　　取金絲桃苷對(duì)照品適量，用甲醇溶解后作紫外全波長(zhǎng)掃描，λ286，370 nm, 因286 nm下非黃酮物質(zhì)也有吸收，為避免干擾，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為370 nm。

　　2.5  線性關(guān)系的考察

　　分別精密吸取0.021 2 mg·ml-1的金絲桃苷對(duì)照品溶液2，4，6，8，10，12，16 μl注入液相色譜儀，測(cè)定基線構(gòu)成之面積稱峰面積。A＝×σ×h＝2.507σh＝1.064 Wh/2h>峰面積，以金絲桃苷含量（X）為橫坐標(biāo)，其峰面積吸收度積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為：Y = 2 263.9X+2.963 5，r = 0.999  8（n =7），表明金絲桃苷在0.04～0.34 μg線性關(guān)系良好。
2.6  精密度實(shí)驗(yàn)

　　精密吸取0.021 2 mg·ml-1金絲桃苷對(duì)照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積積分值RSD為0.86%，表明精密度良好。

　　2.7  重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

　　精密稱取同一樣品粉末1 g（5份），按供試品溶液的制備方法制備，進(jìn)樣10 μl，測(cè)得金絲桃苷含量的RSD為0.99%，表明該方法的重復(fù)性好。

　　2.8  穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)同一供試品溶液，從制備完畢開始放置，分別于0，2，4，6，8，10 h進(jìn)樣檢測(cè)，其峰面積積分值RSD為1.9%。表明供試品溶液在10 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

　　2.9  加樣回收率實(shí)驗(yàn)

　　取已知含量的藥材（6號(hào)含量1.60 mg·g-1）樣品6份，每份0.50 g，精密稱定，計(jì)算樣品中金絲桃苷量，分別加入適量的金絲桃苷對(duì)照品，按樣品制備方法和測(cè)試條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。表1  地榆中金絲桃苷的加樣回收率（略）

　　2.10   樣品測(cè)定

　　分別精密吸取各樣品10 μl進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表2。 表2  不同產(chǎn)地地榆樣品的金絲桃苷含量（略）

　　3  討論

　　3.1  提取條件的選擇

　　根據(jù)金絲桃苷的溶解性能，選擇乙醇、甲醇、醋酸乙酯作為提取溶劑，比較了3種提取溶劑提取方法（超聲、回流及索氏提取）和不同提取時(shí)間（0.5，1.0，1.5 h）對(duì)提取效果的影響。結(jié)果顯示采用超聲提取方法的提取率zui高，甲醇提取效果，含量結(jié)果表明超聲提取1.0 h可使待測(cè)成分提取*。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，含量并未隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)而有所增加，超過(guò)1 h時(shí)含量甚至有下降的趨勢(shì)。

　　3.2   流動(dòng)相的選擇

　　由于金絲桃苷為黃酮類化合物，本實(shí)驗(yàn)采用甲醇和0.2%磷酸溶液的二元流動(dòng)相體系，但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)拖尾峰（tailing peak）。前者少見。>色譜峰有拖尾現(xiàn)象。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在1 000 ml的0.2%磷酸溶液中加入1.8 ml三乙胺時(shí)的分離效果*，經(jīng)多次，多批樣品測(cè)試，系統(tǒng)具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，三乙胺能與ODS柱中鍵合相的殘余硅醇基相互作用，提高分離度，有助于改善峰形。因此以甲醇-0.2%磷酸溶液（46∶54）用三乙胺調(diào)pH至3.0為優(yōu)，分離效果較好，保留時(shí)間適中，且無(wú)干擾［3］。本方法操作簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，適用于地榆中金絲桃苷含量的測(cè)定。

　　3.3  樣品分析

　　本文對(duì)不同產(chǎn)地地榆中的金絲桃苷含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地金絲桃苷的含量存在著一定的差異，有必要對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。

　　《中國(guó)藥典》中地榆質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的定量檢測(cè)方法操作較為繁瑣，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果，RP-HPLC可以較好地對(duì)金絲桃苷進(jìn)行有效分離，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，可作為地榆質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。

　　【參考文獻(xiàn)】
［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典，Ⅰ部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：83.

　　［2］江蘇新醫(yī)學(xué)院. 中藥大辭典，上冊(cè)［M］.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1981：806.

　　［3］沙 明，曹愛民，孟憲生，等.液相色譜法在中藥規(guī)范化研究中的應(yīng)用［M］.沈陽(yáng)：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，2000：24.